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^

A) TINCIÓN DE ESPORAS ( TÉCNICA DE SHEAFFER Y FULTON)


1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de microorganismo uno de Bacillus Suptillus y otro de Bacillus cereus

2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita.

3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)

4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión.

5-Informar: morfología, color y tipo de espora.


El colorante Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.. La Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante


^ TINCIÓN DE ESPORAS ( TÉCNICA DE COLORACIÓN DE GRAM)

1.- Hacer un frotis de B.suptilis de la forma usual y otra de B. cereus

2.- Teñir con la coloración de Gram

3.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersión

las esporas se pueden observar sin teñir o si se encuentra dentro del bacilo, la espora no se tiñe y el citoplasma se ve de color morado






CUESTIONARIO


1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.-¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?

_______________________________________________________________________________

3. ¿Qué característica y que color tiñeron las paredes celulares de las bacterias que lograste observar?

_______________________________________________________________________________

4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

_______________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________
5.- Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una exospora

_______________________________________________________________________________
6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras

microbiológicas?______________________________________________________________

________________________________________________________________________________
7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas

________________________________________________________________________________


OBSERVACIONES


Dibuja las estructuras celulares que lograste observar con el objetivo de inmersión


CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

^ TINCIÓN DE GRAM


Práctica No 11

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________


OBJETIVO


El alumno aplicará una técnica de coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas..


MATERIAL


Asa de platino Cultivos de Escherichia coli

Microscopio Cultivo de Staphylococcus aureus

Porta objetos Cultivo de Cándida albicans

Aceite de inmersión Esputo de tuberculoso procesado en autoclave

^

SUSTACIAS COLORANTES


Colorante violeta cristal de Gram

Solución decolorante alcohol acetona

Safranina de Gram

Yodo de Gram o lugol para gram

INTRODUCCIÓN


TINCION DE GRAM.

Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos ( esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas

Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos ^ Gram. positivos se tiñen de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tiñen de rojo y se dice que son gramnegativos.

Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:

La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos

La presencia de diplococos gramnegativos son características de especies de Neisseria

Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram. positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides)

^ Los bacilos Gram. negativos son las bacterias mas comunes halladas en los laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus.

El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.


PROCEDIMIENTO


^ REALIZACIÓN DEL FROTIS

  1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.

  2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

  3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

  1. ^ TINCIÓN DE GRAM

  1. Realiza la preparación del frotis bacteriano como se explicó en el paso anterior

  2. Teñir con cristal violeta 1min.

  3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

  4. Cubrir con Lugol 1min.

  5. Lavar con agua el exceso de Lugol.

  6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg)

  7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

  8. Teñir con safranina 1min.

  9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

  10. Secar la preparación.

  11. Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre todo en el color de cada preparación.



CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un frotis?

­­­­­­­­­­­­­________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3.-¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?
________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los microorganismos?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5.-De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que funciona como colorante primario?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


6.-¿Qué función tiene el Yodo en la tinción de Gram?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7.-¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram positivas?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8.- ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram. negativas?


9.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


10.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


OBSERVACIONES:


Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas


CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

^




TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE

Práctica No 12


Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________


OBJETIVO:


El alumno aplicará las técnicas de coloración de microorganismos ácido-resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades morfológicas


MATERIAL:


*Un cultivo de 72 horas de mycobacterium. Si es posible se les facilitará un esputo de tuberculoso procesado en autoclave.

* Un cultivo de 24 horas de streptococcus
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